Морфофункціональні зміни мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини в процесі остеогенного диференціювання in vitro.
Для вивчення морфофункціональних властивостей мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) у процесі остеогенного диференціювання in vitro проводили остеогенну індукцію МСК, отриманих від 21 хворого з тривалим незрощенням переломів, за допомогою остеоіндукувального культурального середовища, що містило дексаметазон, β-гліцерофосфат і L-аскорбінову кислоту. Оцінку процесів остеогенного диференціювання здійснювали за наявністю продукції клітинами лужної фосфатази (ЛФ) та остеопонтину (ОП). Також вивчали проліферативну активність і морфологічні зміни МСК у процесі остеогенного диференціювання.
Продукція лужної фосфатази та остеопонтину в процесі остеогенної індукції МСК дексаметазоном in vitro (функціональні зміни).
За даними різних авторів, у процесі остеогенної індукції активація генів ЛФ та ОП починається приблизно з 7-9 доби інкубації клітинних культур з остеоіндукувальними агентами. У зв'язку з цим детекцію ЛФ та ОП в остеоіндукованих культурах здійснювали з 4 по 19 добу кожні три доби.
У таблиці 1 наведено дані зміни активності продукції ЛФ остеоіндукованими МСК.
З таблиці видно, що ЛФ остеоіндукованими клітинами починала продукуватися з 7 доби. На цей час ЛФ продукували 9,5±0,8% клітин культури. Протягом наступних діб (з 7 по 19 добу) продукція ЛФ статистично значуще зростала і була вищою, ніж на 7 добу (p<0,01). Найбільший «стрибок» активності продукції ЛФ клітинами відбувався між 7 і 10 добами індукції. До 10 доби індукції ЛФ продукували 76,2±7,1% МСК (p<0,01). До 13 доби продукція ЛФ спостерігалася у 90,7±6,5% клітин, однак статистично значущих відмінностей порівняно з 10 добою не було (р>0,05). У наступні доби остеогенної індукції (з 13 по 19 добу) кількість клітин у культурі, що продукували ЛФ, зберігалася на одному рівні (р>0,05) (рис. 1).
Продукція ОП остеоіндукованими клітинами, так само як і продукція ЛФ, починалася з 7 доби індукування – на цей час ОП продукували 10,5±1,3% МСК (табл. 2).
Упродовж 10-19 діб кількість клітин, що продукували ОП, статистично значуще зростала і була вищою, ніж на 7 добу (p<0,01) (рис. 4.2а, б). Але, на відміну від ЛФ, продукція ОП зростала поступово. На 10 добу ОП продукували понад 48,5±3,3% клітин культури (р<0,01 відносно 7 доби), а на 13 добу – 91,5±2,5% клітин культури (р<0,01 відносно 10 доби) (рис. 2 в, г). Упродовж 13-19 діб індукування кількість клітин, що продукували ОП, залишалася незмінною (р>0,05) (рис. 3).
Морфологічні зміни МСК у процесі остеогенної індукції in vitro.
При остеогенній індукції МСК, окрім активної продукції ЛФ та ОП, змінювали свою морфологію. На 7 добу в культурі МСК спостерігалися веретеноподібні фібробластоподібні недиференційовані клітини з наявністю поодиноких розпластаних клітин, що продукували ЛФ (рис. 4а). На 13 добу індукції клітини утворювали моношар із паралельно розташованими малодиференційованими веретеноподібними клітинами (рис. 4б). До 16 доби індукування клітини розпластувалися і набували округло-багатокутної форми з вираженими відростками цитоплазми (рис. 5а). До 19 доби індуковані клітини утворювали стратифіковані щільні напівсферичні скупчення, що активно секретували ЛФ (рис. 5б).
Під час МТТ-аналізу було встановлено, що проліферація МСК у процесі їхньої остеогенної індукції різко знижувалася до 13 доби, а до 19 доби – практично повністю зупинялася (табл. 3).
Таким чином, у процесі остеогенної індукції МСК зазнають морфофункціональних змін. На 7 добу остеогенної індукції МСК починають продукувати ЛФ та ОП. До 13 доби секреція ЛФ та ОП досягає максимуму і зберігається на цьому рівні протягом усього періоду спостереження. У процесі остеоіндукування МСК з активно проліферуючих веретеноподібних і недиференційованих клітин поступово перетворюються на розпластані, остеогенно диференційовані та непроліферуючі клітини, що утворюють напівсферичні скупчення.
Морфофункціональні зміни мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку людини в процесі остеогенного диференціювання in vitro.
Для вивчення морфофункціональних властивостей мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) у процесі остеогенного диференціювання in vitro проводили остеогенну індукцію МСК, отриманих від 21 хворого з тривалим незрощенням переломів, за допомогою остеоіндукувального культурального середовища, що містило дексаметазон, β-гліцерофосфат і L-аскорбінову кислоту. Оцінку процесів остеогенного диференціювання здійснювали за наявністю продукції клітинами лужної фосфатази (ЛФ) та остеопонтину (ОП). Також вивчали проліферативну активність і морфологічні зміни МСК у процесі остеогенного диференціювання.
Продукція лужної фосфатази та остеопонтину в процесі остеогенної індукції МСК дексаметазоном in vitro (функціональні зміни).
За даними різних авторів, у процесі остеогенної індукції активація генів ЛФ та ОП починається приблизно з 7-9 доби інкубації клітинних культур з остеоіндукувальними агентами. У зв'язку з цим детекцію ЛФ та ОП в остеоіндукованих культурах здійснювали з 4 по 19 добу кожні три доби.
У таблиці 1 наведено дані зміни активності продукції ЛФ остеоіндукованими МСК.
З таблиці видно, що ЛФ остеоіндукованими клітинами починала продукуватися з 7 доби. На цей час ЛФ продукували 9,5±0,8% клітин культури. Протягом наступних діб (з 7 по 19 добу) продукція ЛФ статистично значуще зростала і була вищою, ніж на 7 добу (p<0,01). Найбільший «стрибок» активності продукції ЛФ клітинами відбувався між 7 і 10 добами індукції. До 10 доби індукції ЛФ продукували 76,2±7,1% МСК (p<0,01). До 13 доби продукція ЛФ спостерігалася у 90,7±6,5% клітин, однак статистично значущих відмінностей порівняно з 10 добою не було (р>0,05). У наступні доби остеогенної індукції (з 13 по 19 добу) кількість клітин у культурі, що продукували ЛФ, зберігалася на одному рівні (р>0,05) (рис. 1).
Продукція ОП остеоіндукованими клітинами, так само як і продукція ЛФ, починалася з 7 доби індукування – на цей час ОП продукували 10,5±1,3% МСК (табл. 2).
Упродовж 10-19 діб кількість клітин, що продукували ОП, статистично значуще зростала і була вищою, ніж на 7 добу (p<0,01) (рис. 4.2а, б). Але, на відміну від ЛФ, продукція ОП зростала поступово. На 10 добу ОП продукували понад 48,5±3,3% клітин культури (р<0,01 відносно 7 доби), а на 13 добу – 91,5±2,5% клітин культури (р<0,01 відносно 10 доби) (рис. 2 в, г). Упродовж 13-19 діб індукування кількість клітин, що продукували ОП, залишалася незмінною (р>0,05) (рис. 3).
Морфологічні зміни МСК у процесі остеогенної індукції in vitro.
При остеогенній індукції МСК, окрім активної продукції ЛФ та ОП, змінювали свою морфологію. На 7 добу в культурі МСК спостерігалися веретеноподібні фібробластоподібні недиференційовані клітини з наявністю поодиноких розпластаних клітин, що продукували ЛФ (рис. 4а). На 13 добу індукції клітини утворювали моношар із паралельно розташованими малодиференційованими веретеноподібними клітинами (рис. 4б). До 16 доби індукування клітини розпластувалися і набували округло-багатокутної форми з вираженими відростками цитоплазми (рис. 5а). До 19 доби індуковані клітини утворювали стратифіковані щільні напівсферичні скупчення, що активно секретували ЛФ (рис. 5б).
Під час МТТ-аналізу було встановлено, що проліферація МСК у процесі їхньої остеогенної індукції різко знижувалася до 13 доби, а до 19 доби – практично повністю зупинялася (табл. 3).
Таким чином, у процесі остеогенної індукції МСК зазнають морфофункціональних змін. На 7 добу остеогенної індукції МСК починають продукувати ЛФ та ОП. До 13 доби секреція ЛФ та ОП досягає максимуму і зберігається на цьому рівні протягом усього періоду спостереження. У процесі остеоіндукування МСК з активно проліферуючих веретеноподібних і недиференційованих клітин поступово перетворюються на розпластані, остеогенно диференційовані та непроліферуючі клітини, що утворюють напівсферичні скупчення.