Морфо-функциональные изменения мезенхимальных стволовых клеток

Морфо-функциональные изменения мезенхимальных стволовых клеток

Морфо-функциональные изменения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека в процессе остегенной дифференцировки in vitro.

Для изучения морфофункциональных свойств мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в процессе остеогенной дифференцировки in vitro проводили остеогенную индукцию МСК, полученных от 21 больного с длительным несрастанием переломов, при помощи остеоиндуцирующей культуральной среды, содержащей дексаметазон, β-глицерофосфат и L-аскорбиновую кислоту. Оценка процессов остеогенной дифференцировки осуществлялась по наличию продукции клетками щелочной фосфатазы (ЩФ) и остеопонтина (ОП). Также изучались пролиферативная активность и морфологические изменения МСК в процессе остеогенной дифференцировки.

Продукция щелочной фосфатазы и остеопонтина в процессе остеогенной индукции МСК дексаметазоном in vitro (функциональные изменения).

По данным различных авторов, в процессе остегенной индукции активация генов ЩФ и ОП начинается приблизительно с 7-9 суток инкубации клеточных культур с остеоиндуцирующими агентами. В связи с этим детекция ЩФ и ОП в остеоиндуцированных культурах осуществлялась с 4 по 19 сутки каждые третьи сутки.

В таблице 1 представлены данные изменения активности продукции ЩФ остеоиндуцированными МСК.

Из таблицы видно, что ЩФ остеоиндуцированными клетками начинала продуцироваться с 7 суток. К этому времени ЩФ продуцировали 9,5±0,8% клеток культуры. На протяжении последующих суток (с 7 по 19 сутки) продукция ЩФ статистически значимо возрастала и была выше, чем на 7 сутки (p<0,01). Наибольший «скачок» активности продукции клетками ЩФ происходил между 7 и 10 сутками индукции. К 10 суткам индукции ЩФ продуцировали 76,2±7,1% МСК (p<0,01). К 13 суткам продукция ЩФ наблюдалась у 90,7±6,5% клеток, однако статистически значимых различий по сравнению с 10 сутками не было (р>0,05). В последующие сутки остеогенной индукции (с 13 по 19 сутки) количество клеток в культуре, продуцирующих ЩФ, сохранялось на одном уровне (р>0,05) (рис. 1).

Продукция ОП остеоиндуцированными клетками, так же, как и продукция ЩФ, начиналась с 7 суток индуцирования – к этому времени ОП продуцировали 10,5±1,3% МСК (табл. 2)

В течение 10-19 суток количество клеток, продуцирующих ОП, статистически значимо возрастало и было выше, чем на 7 сутки (p<0,01) (рис 4.2а, б). Но, в отличие от ЩФ, продукция ОП возрастала постепенно. На 10 сутки ОП продуцировали более 48,5±3,3% клеток культуры (р<0,01 по отношению к 7 суткам), а на 13 сутки – 91,5±2,5% от клеток культуры (р<0,01 по отношению к 10 суткам) (рис 2 в, г). В течение 13-19 суток индуцирования количество клеток, продуцирующих ОП, оставалось прежним (р>0,05) (рис. 3).

 

Морфологические изменения МСК в процессе остеогенной индукции in vitro.

При остеогенной индукции МСК кроме активной продукции ЩФ и ОП изменяли свою морфологию. На 7 сутки в культуре МСК наблюдались веретенообразные фибробластоподобные недифференцированные клетки с наличием единичных распластанных клеток, продуцирующих ЩФ (рис. 4а). На 13 сутки индукции клетки образовывали монослой с расположенными параллельно малодифференцированными веретенообразными клетками (рис. 4б). К 16 суткам индуцирования клетки распластывались и приобретали округло-многоугольную форму с выраженными выростами цитоплазмы (рис. 5а). К 19 суткам индуцированные клетки образовывали стратифицированные плотные полусферические скопления, активно секретирующие ЩФ (рис. 5б).

При МТТ-анализе было установлено, что пролиферация МСК в процессе их остеогенной индукции резко снижалась к 13 суткам, а к 19 суткам – практически полностью останавливалась (табл. 3).

Таким образом, в процессе остеогенной индукции МСК претерпевают морфофункциональные изменения. На 7 сутки остеогенной индукции МСК начинают продуцировать ЩФ и ОП. К 13 суткам секреция ЩФ и ОП достигает своего максимума и сохраняется на этом уровне в течение всего срока наблюдения. В процессе остеоиндуцирования МСК из активно пролиферирующих веретенообразных и недифференцированных клеток постепенно превращаются в распластанные, остеогенно дифференцированные и непролиферирующие клетки, образующие полусферические скопления.